Die DNA-Sequenzierung ist die gängigste Methode zur Untersuchung von Mikroben bei Menschen, Tieren, Lebensmitteln und in der Umwelt. Der Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung und die DNA-Sequenzierung besteht aus zahlreichen Schritten, die anfällig für Verzerrungen und Kontaminationsprobleme sind. In der vielfältigen Mikrobiota von hochwertiger Vollmilch sind zahlreiche Bakterienarten vorhanden. Innerhalb der hier vorliegenden Studie von Xue et al. wurden die folgenden Bakterienstämme verwendet:
Bacillus subtilis
Clostridium tyrobutyricum
Corynebacterium bovis
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Lactococcus lactis
Pseudomonas fluorexcens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus agalactiae
Bakterielle Cell-Mock-Community (BCMC)
Neun Stämme in BCMC1 wurden bis zu einer nahezu stationären Phase gezüchtet und direkt unter dem Mikroskop gezählt. Die soeben hergestellten BCMC2-Pools wurden entweder sofort zur DNA-Extraktion verwendet oder bei -80°C aufbewahrt. Zur Gewinnung der Bakterien wurden BCMC1 und BCMC2 mit ultrahocherhitzter, pasteurisierter Milch beimpft und vor der DNA-Extraktion fünf Minuten lang bei 4°C bei 13.000 zentrifugiert. Sie wurden sieben Tage lang bei -20°C in PBS oder PBS mit 25% v/v Glycerin aufbewahrt.
Methoden zur Zelllyse und DNA-Aufreinigung
Es ist möglich, dass Escherichia coli und Pseudomonas empfindlicher auf DNA-Scheren und -Lyse reagieren als Gram-positive Bakterien. B5 (10 Sekunden langes Abklopfen mit 4 m/sec) und V3 (30 Sekunden langes Vortexen bei 1800 U/min) waren zwei der milderen Methoden, die zum Aufbrechen der Zellen ausprobiert wurden. Drei MagMAX-DNA-Reinigungskits Total, Core und Ultra2 wurden miteinander verglichen, und das Total-Kit lieferte genaueste Ergebnisse.
Auswirkungen der BCMC-Präparationsmethode auf die Schätzung der Zusammensetzung der Gemeinschaft
Für jedes BCMC wurde die 16S rRNA V4-Region sequenziert und analysiert, um die Anteile zu ermitteln, die „beobachtet“ wurden. Escherichia und Pseudomonas waren signifikant niedriger als erwartet, und Bacillus und Corynebacterium waren signifikant höher als für BCMC1 erwartet.
Auswirkungen von Milchprobenvolumen und Zellzahl auf die Schätzungen der bakteriellen Zusammensetzung
Größere Milchproben führten zu geringerer Alpha-Diversität und weniger unerwarteten Taxa-Zuordnungen oder Bakterien, die nicht zur Scheingemeinschaft gehörten. Bei den meisten dieser unerwarteten Bakterien handelte es sich um Micrococcus bzw. Tepidimonas.
Auswirkungen der Lagerungsmethode auf die Erkennung von Scheingemeinschaften
Unabhängig davon, ob die Zellen in PBS oder in Wasser mit 25 % v/v Glycerin bei -20 °C eingefroren wurden, änderten sich die bakteriellen Anteile von BCMC nicht.
Identifizierung und Verfolgung von Bakterien
Mit Hilfe von 16S rRNA-Gensequenzerhebungen ist es möglich, Bakterienpopulationen zu identifizieren und zu verfolgen. In fast jeder Phase des Prozesses, von der Probenahme bis hin zur Datenanalyse und -interpretation, kann es jedoch zu Verzerrungen kommen. Die genaueste Methode zur automatischen Identifizierung von Bakterien besteht aus mindestens 10 Gramm Milch, einer milden Zelllyse, einer Behandlung mit Proteinase K und einer DNA-Reinigung auf der Basis von Magnetkügelchen.
Lagerungsbedingungen der gesammelten Zellen und Zelllysemethode
Die Mock-Community blieb trotz unterschiedlicher Gefrier-Auftau-Zyklen und Lagerungsbedingungen unverändert. Es ist davon auszugehen, dass andere vorgelagerte Probenvorbereitungsschritte einen größeren Einfluss haben als dieser, der zuvor entdeckt wurde. Obwohl dies nicht direkt getestet wurde, wurde bereits früher nachgewiesen, dass Flüssigmilchproben direkt eingefroren werden können, wenn ein schneller Kältetransfer zwischen den Entnahmestellen nicht möglich ist.
Anwendung von Zelllyse- und DNA-Extraktionsmethoden zur Bewertung der Mikrobiota von roher und pasteurisierter Milch
Obwohl Zelllysetechniken die Ergebnisse der 16S rRNA-Genamplikon-DNA-Sequenzierung verfälschen können, ist es unwahrscheinlich, dass sie vergleichende Mikrobiota-Studien verschiedener Milchproben behindern. Die durch methodische Anpassungen verursachte Variation innerhalb einer Probe war deutlich geringer als die Variation zwischen den Proben. Die mikrobielle DNA-Extraktion und -Analyse erfordert möglicherweise unterschiedliche methodische Ansätze für die verschiedenen Arten von Kuhmilchproben.
Zusammenfassung
Die Untersuchung der Mikrobiota von Milchprodukten erfordert eine sorgfältige Probenvorbereitung und -analyse, um Verzerrungen und Kontaminationsprobleme zu minimieren. Die Verwendung einer bakteriellen Cell-Mock-Community (BCMC) kann helfen, die Genauigkeit der Ergebnisse zu überprüfen und zu verbessern. Bei der Auswahl von Zelllyse- und DNA-Aufreinigungsmethoden sollten mildere Techniken bevorzugt werden, um Verzerrungen zu vermeiden. Die Lagerungsbedingungen der gesammelten Zellen sollten ebenfalls sorgfältig kontrolliert werden, um Veränderungen in der bakteriellen Zusammensetzung zu vermeiden. Die Anwendung von 16S rRNA-Gensequenzerhebungen kann helfen, Bakterienpopulationen zu identifizieren und zu verfolgen, jedoch müssen mögliche Verzerrungen berücksichtigt werden.
Probenlagerung und –vorbereitung von Vollmilchproben zur Bestimmung der Mikrobiota – #JournalClub no.054
Improved assessments of bulk milk micro-biota composition via sample preparation and DNA extraction methods
Xue Z, Marco ML. Improved assessments of bulk milk microbiota composition via sample preparation and DNA extraction methods. PLOS ONE. 2022;17(9):e0267992. doi:10.1371/journal.pone.0267992
Die DNA-Sequenzierung ist die gängigste Methode zur Untersuchung von Mikroben bei Menschen, Tieren, Lebensmitteln und in der Umwelt. Der Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung und die DNA-Sequenzierung besteht aus zahlreichen Schritten, die anfällig für Verzerrungen und Kontaminationsprobleme sind. In der vielfältigen Mikrobiota von hochwertiger Vollmilch sind zahlreiche Bakterienarten vorhanden. Innerhalb der hier vorliegenden Studie von Xue et al. wurden die folgenden Bakterienstämme verwendet:
Bakterielle Cell-Mock-Community (BCMC)
Neun Stämme in BCMC1 wurden bis zu einer nahezu stationären Phase gezüchtet und direkt unter dem Mikroskop gezählt. Die soeben hergestellten BCMC2-Pools wurden entweder sofort zur DNA-Extraktion verwendet oder bei -80°C aufbewahrt. Zur Gewinnung der Bakterien wurden BCMC1 und BCMC2 mit ultrahocherhitzter, pasteurisierter Milch beimpft und vor der DNA-Extraktion fünf Minuten lang bei 4°C bei 13.000 zentrifugiert. Sie wurden sieben Tage lang bei -20°C in PBS oder PBS mit 25% v/v Glycerin aufbewahrt.
Methoden zur Zelllyse und DNA-Aufreinigung
Es ist möglich, dass Escherichia coli und Pseudomonas empfindlicher auf DNA-Scheren und -Lyse reagieren als Gram-positive Bakterien. B5 (10 Sekunden langes Abklopfen mit 4 m/sec) und V3 (30 Sekunden langes Vortexen bei 1800 U/min) waren zwei der milderen Methoden, die zum Aufbrechen der Zellen ausprobiert wurden. Drei MagMAX-DNA-Reinigungskits Total, Core und Ultra2 wurden miteinander verglichen, und das Total-Kit lieferte genaueste Ergebnisse.
Auswirkungen der BCMC-Präparationsmethode auf die Schätzung der Zusammensetzung der Gemeinschaft
Für jedes BCMC wurde die 16S rRNA V4-Region sequenziert und analysiert, um die Anteile zu ermitteln, die „beobachtet“ wurden. Escherichia und Pseudomonas waren signifikant niedriger als erwartet, und Bacillus und Corynebacterium waren signifikant höher als für BCMC1 erwartet.
Auswirkungen von Milchprobenvolumen und Zellzahl auf die Schätzungen der bakteriellen Zusammensetzung
Größere Milchproben führten zu geringerer Alpha-Diversität und weniger unerwarteten Taxa-Zuordnungen oder Bakterien, die nicht zur Scheingemeinschaft gehörten. Bei den meisten dieser unerwarteten Bakterien handelte es sich um Micrococcus bzw. Tepidimonas.
Auswirkungen der Lagerungsmethode auf die Erkennung von Scheingemeinschaften
Unabhängig davon, ob die Zellen in PBS oder in Wasser mit 25 % v/v Glycerin bei -20 °C eingefroren wurden, änderten sich die bakteriellen Anteile von BCMC nicht.
Identifizierung und Verfolgung von Bakterien
Mit Hilfe von 16S rRNA-Gensequenzerhebungen ist es möglich, Bakterienpopulationen zu identifizieren und zu verfolgen. In fast jeder Phase des Prozesses, von der Probenahme bis hin zur Datenanalyse und -interpretation, kann es jedoch zu Verzerrungen kommen. Die genaueste Methode zur automatischen Identifizierung von Bakterien besteht aus mindestens 10 Gramm Milch, einer milden Zelllyse, einer Behandlung mit Proteinase K und einer DNA-Reinigung auf der Basis von Magnetkügelchen.
Lagerungsbedingungen der gesammelten Zellen und Zelllysemethode
Die Mock-Community blieb trotz unterschiedlicher Gefrier-Auftau-Zyklen und Lagerungsbedingungen unverändert. Es ist davon auszugehen, dass andere vorgelagerte Probenvorbereitungsschritte einen größeren Einfluss haben als dieser, der zuvor entdeckt wurde. Obwohl dies nicht direkt getestet wurde, wurde bereits früher nachgewiesen, dass Flüssigmilchproben direkt eingefroren werden können, wenn ein schneller Kältetransfer zwischen den Entnahmestellen nicht möglich ist.
Anwendung von Zelllyse- und DNA-Extraktionsmethoden zur Bewertung der Mikrobiota von roher und pasteurisierter Milch
Obwohl Zelllysetechniken die Ergebnisse der 16S rRNA-Genamplikon-DNA-Sequenzierung verfälschen können, ist es unwahrscheinlich, dass sie vergleichende Mikrobiota-Studien verschiedener Milchproben behindern. Die durch methodische Anpassungen verursachte Variation innerhalb einer Probe war deutlich geringer als die Variation zwischen den Proben. Die mikrobielle DNA-Extraktion und -Analyse erfordert möglicherweise unterschiedliche methodische Ansätze für die verschiedenen Arten von Kuhmilchproben.
Zusammenfassung
Die Untersuchung der Mikrobiota von Milchprodukten erfordert eine sorgfältige Probenvorbereitung und -analyse, um Verzerrungen und Kontaminationsprobleme zu minimieren. Die Verwendung einer bakteriellen Cell-Mock-Community (BCMC) kann helfen, die Genauigkeit der Ergebnisse zu überprüfen und zu verbessern. Bei der Auswahl von Zelllyse- und DNA-Aufreinigungsmethoden sollten mildere Techniken bevorzugt werden, um Verzerrungen zu vermeiden. Die Lagerungsbedingungen der gesammelten Zellen sollten ebenfalls sorgfältig kontrolliert werden, um Veränderungen in der bakteriellen Zusammensetzung zu vermeiden. Die Anwendung von 16S rRNA-Gensequenzerhebungen kann helfen, Bakterienpopulationen zu identifizieren und zu verfolgen, jedoch müssen mögliche Verzerrungen berücksichtigt werden.